REKAYASA GENETIKA 1

Defenisi

• Rekayasa genetik adalah manipulasi DNA dengan menggunakan teknik DNA rekombinan.
  
• Teknik DNA rekombinan: DNA dipotong kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran setelah itu disekuensing untuk menentukan komposisi dan urutan nukleotidanya. OK
  

Tujuan

1. Isolasi gen tertentu, bagian dari gen atau daerah genomnya.
2. Menghasilkan RNA atau molekul protein yang diinginkan dalam jumlah banyak
3. Meningkatkan efisiensi dalam pembuatan enzim dan obat-obatan secara komersil
4. Memodifikasi organisme, sehingga dapat mengekspresikan suatu sifat baru yang sebelumnya tidak dikode oleh gen.
5. Koreksi kelainan genetik di organisme, termasuk manusia.

Peralatan

• Peralatannya meliputi Polmerase Chain Reaction (PCR)
• PCR digunakan untuk memperbanyak DNA supaya dapat dianalisis, elektroforesis, etc.

Teknik Rekayasa Genetik

Struktur DNA

• DNA merupakan polimer dari nukleotida yang terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa Nitrogen. Gula deoksiribosa terbentuk karena atom C no.2 pada gula ribosa kehilangan oksigen.
• Basa N terdiri dari purin (adenin & guanin) dan pirimidin (cytosin & timin).
• Basa N membentuk ikatan hidrogen dengan komplementernya, A x T dan G x C à membentuk untai nukleotida yang anti paralel.
  
• Untai pertama tersusun oleh nukleotida dari arah 3’ ke 5’, sedangkan pasangannya terususun dari arah 5’ ke 3’.
  
• Struktur inilah yang membentuk double helix pada DNA.
  
• Replikasi Semikonservatif merupakan proses replikasi DNA yang menunjukkan kemampuan penurunan sifat yang merupakan gabungan rantai DNA parenatal dan baru yang dibentuk
  

Proses replikasi

• Secara in vivo, terjadi replikasi dari arah 5’ ke 3’.
• Terbentuk dua untai yang disebut leading strand dan lagging strand.
• Lagging strand, untainya direplikasi terputus-putus, membentuk fragmen yang disebut fragment okazaki.

• BP membant fiksasi untai DNA template yang telah terbuka untuk mencegah kedua untai bersatu kembali.\
• Oleh karena itu, prinsip replikasi selalu diawali dengan membuka rantai DNA sense sehingga terpisah dengan rantai anti sense DNA.
• Prinsip ini dapat diterapkan dalam denaturasi DNA secara in vitro.
• Adonannya: DNA sbg template, topoisomerase, DNA polimerase III, etc.
  
• DNA terdenaturasi melalui pemanasan, memerlukan suhu yang sangat tinggi, 90-950 C.

Enzim Restriksi Endonuklease

• Enzim dapat memotong DNA pada untai tertentu, memotong ikatan fosfodiester kedua untai.
• Tempat pemotongannya (restriction site) dinamakan palindrom
• Prinsipnya seperti cermin, di mana untai 3’ ke 5’ menjadi cermin 5’ ke 3’.
  
• Ex: Pada untai 3’ ke 5’ terbentuk urutan G A A T T C, maka cerminnya adalah kebalikan dari urutan basa N tersebut, C T T A A G.
• DNA yang kepotong bisa jadi berekor(sticky end) atau berujung rata (blunt end).
• Untuk yang ujung rata kodenya CCCGGG yg berpasangan dengan GGGCCC.

• Kalo ekor, dipotong di urutan nukleotida G AATTC. Yang berekor ini lebih baik digunakan karena ia membentuk lock and key dengan tempat pemotongan pada vektor, misalnya plasmid bakteri.
• Potongan DNA ini disebut fragment restriksi.
• Bakteri memiliki kromosomal (mencapai Mega bp) dan ekstrakromosomal (k bp) yang disebut plasmid.
  
• Plasmid biasa digunakan untuk kloning karena dapat bereplikasi secara mandiri, dan banyak mengandung restriction site.

Bagaimana melakukan kloning DNA ke plasmid?

1. diperlukan enzim Endonuklease restriksi dan
   
2. Enzim ligase.

Enzim Ligase

• Ligase adalah enzim yang menautkan 2 fragmen DNA dengan menyambung ikatan gula- fosfat yang terpotong endonuklease.
• Misalnya, insert (DNA yang akan diklon) memiliki situs potongan untuk Enzim EcoR1, vektor DNA (plasmid) juga harus punya à samakan, kemudian dipotong à membentuk sticky end.
  
• Dengan bantuan ligase, keduanya akan menyambung, dan terbentuk molekul rekombinan.
• Suatu plasmid memiliki situs pemotongan untuk enzim Alu I dan Hind III.
  
• Dipilih enzim yang memotong sesuai keinginan, jangan sampai motong di sembarang tempat.
• Tidak ketemu trus bagaimana ?
  
• Direkayasakan dengan PCR
  
• Caranya daerah tersebut diamplifikasi, primernya disisipi dengan daerah yang bisa dikenali, sehingga amplifikasi bisa dilakukan dengan enzim yang tadinya tidak bisa digunakan.

• Tidak semua mikroorganisme memiliki DNA, ada virus yang materi genetiknya RNA.
  
• Dalam kloning, kita akan menggunakan materi genetik yang berupa DNA.
  
• Bagaimana dengan virus RNA?
• ada Enzim Reverse Transkriptase

Enzim Reverse Transkriptase

• Digunakan reverse transkiptase. Enzim ini bertolakbelakang dengan dogma sentral: DNA àRNA à protein.
• Dahulu, orang berpikir, enzim tidak bisa balik.
  
• Tidak bisa menjadi RNA lagi karena mengalami processing, sehingga gen manusia jika diamplifikasi akan sukar karena memiliki ekson dan intron yang tidak mengkode gen.
  
• Klon DNA yang gennya dibatasi oleh intron, jika dimasukkan ke dalam PCR, daerah intronnya yang tidak dibutuhkan akan ikut teramplifikasi.
• RNA ternyata dapat diranskripsi balik menjadi DNA. Dengan reverse dari RNA yang hanya mengandung exon (intronnya telah dibuang melalui splicing) à diperoleh DNA.
• Caranya terus bagaimana ?
  
• Template berupa RNA yang memiliki ekor yang kaya akan polinukleotida A (AAAA) di ujung 3’. DNA primer berisi oligo dT (TTTT) akan berikatan dengan ekor RNA sebagai pasangan poli A, lalu dielongasi dari arah 5’ ke 3’ dengan reverse transkriptase.
  
• Terbentulah cDNA, komplementernya.
• Setelah selesai, cDNA akan menjadi template untuk replikasi pasangannya à terbentuklah cDNA untai ganda à diperbanyak dengan PCR, lalu dipotong dengan retriksi endonuklease à diklon.

Bagaimana kita mengetahui klon telah berhasil atau tidak?

• Genome dan Analisis Protein
• Untuk mengetahui keberhasilan kloning, digunakan jel elektroforesis
  
• Penggunaan elektroforesis dengan menggunakan jel agarosa atau poliakrimilamida.
• Di agar, lalu dibuat cetakannya, kemudian diberkukan à cetakan sumur diberikan DNA hasil amplifikasi.
• DNA bermuatan negatif karena gugus fosfat à DNA akan berjalan ke kutub positif.
• Hasilnya berupa separasi DNA berdasarkan berat molekulnya.
  
• DNA juga akan terpisah sesuai berat molekulnya.

• Misalnya 500 kb akan berbeda dengan 300 kb.
  
• Yang paling jauh adalah 300 karena lebih kecil, sehingga lebih mudah melewati pori-pori.

• Pengecekan dapat menggunakan marker.
  
• Jika 300 yang kita amplifikasi, garis visualisasi yang terbentuk pada agar akan berada di sekitar daerah 300 pada marker.
  
• Marker adalah DNA yang dipotong-potong pada daerah tertentu yang berfungsi seperti skala dengan ukuran tertentu.

• Ex: Hasil elektroforesis DNA Lambda yang dipotong pake EcoRI.
  
• DI sini bisa dilihat, ada berbagi macam ukuran dari potongan EcoRI.
  
• Setelah dielektroforesis, DNA yg terdiri dari 21.2 kb (paling gede) akan berada paling jauh dari kutub positif dan garisnya kelihatan tebal. Klo yg 3,6 kb paling dekat ke kutub positif.
  
• Menunjukkan semakin kecil BM semakin cepat migrasinya ke kutub yg berlawanan.
  
• Yg gede, yah harus jalan lambat karena kegedean. Meskipun kesannya the biggest loser, to be honest, big means beautiful! :D

Hibridasi Asam Nukleat dan Pelacak (Probe)

• Produk yang diinginkan bisa dideteksi atau dilacak denga probe.
• DNA ketika didenaturasi akan menjadi ssDNA, jika didinginkan akan terjadi renaturasi menjadi dsDNA.
• Dua untai asam nukleat dengan urutan basa yang saling berkomplementer, dapat bergabung satu sama lain. Gabungan ini dapat berupa DNA-DNA, DNA- RNA, dan RNA-RNA. Sifat ini digunakan untuk merancang oligonukleotida yang mengenali fragmen/sekuens DNA tertentu yang ingin dicari dengan pelacak/probe. Supaya bisa dilihat, probenya dilabel dengan radioaktif atau enzim. Teknik mendeteksi asam nukleat tertentu dengan probe RNA atau DNA inilah yang disebut hibridisasi.
• Radioaktif maupun enzim memiliki manfaat dan mudarat (kerugian) masing- masing. Radioaktif memiliki sensitifitas yang tinggi, apalagi pada DNA yang berukuran kecil, tetapi dapat berpotensi memancarkan radiasi, seperti neutron yag dapat masuk ke dalam kulit dan mematahkan DNA yang menyandi sel epidermis. Akibatnya, kulit terbuka, sehingga harus dirawat di ruang steril.
• Penggunaan Enzim kurang sensitif, tetapi resikonya jauh lebih kecil dibanding radioaktif, sehingga tidak diperlukan peralatan mahal seperti antiradioaktif.

Penggunaan Mekanisme Blot

• Mekanisme blot: Sampel dilarikan pada elektroforesis jel agarosa à blot ke membran à hibridisasi dengan pelacak berlabel àvisualisasi.
• Terdapat Southern Blot untuk sampel DNA dan Northern blot untuk sampel RNA.
  
• Di samping itu, adapula hibridasisi balik tanpa label radioaktif.
  
• Hasilnya nanti dianalisis.

• Hasil analisis dapat dihasilkan gambar yang menyerupai titik2 hitam yang banyak, digunakan untuk mengetahui dan membedakan strain dari suatu mikroorganisme penyebab infeksi suatu penyakit.
• Ex: dalam suatu keluarga yang terkena TB,
  
• Apakah penularan pada anak disebabkan oleh penularan dari ayah.
  
• Atau ketika seseorang menderita suatu penyakit enam bulan lalu. Ingin diketahui apa ia sembuh dan terapinya berhasil.
• Pada pemeriksaan awal, dicek dan hasilnya dijadikan sebagai database untuk dibandingkan dengan pemeriksaan 6 bulan kemudian.
  
• Jika sama, pasien masih terinfeksi bakteri yang sama dan disimpulkan bahwa terapinya belum berhasil.

PCR

• PCR ibarat seperti pintu. Apakah mutasi ini dapat menyebabkan suatu penyakit itu hanya dapat dilakukan jika sampel diperbanyak hingga jutaan kopi.
• Dulu ditaruh dalam wadah berbeda-beda. 30 siklus, berarti 2 pangkat 30. Hasil akhirnya berupa miliaran kopi.
  

Memperbanyak DNA secara in vitro (di luar jaringan)

• Dibutuhkan primer, yaitu oligonukleotida sintetis yang dirancang untuk mengenali bagian DNA yang akan diamplifikasi à memungkinkan terjadinya polimerasi/ pemanjangan untai DNA. Diperlukan suhu tinggi untuk denaturasi DNA. Dibandingkan dengan probe, primer pada PCR harus memiliki syarat- syarat tertentu, yaitu memiliki panjang antara 21-23bp dan bisa melakukan annealing di suhu tertentu.

• Walaupun kita sudah mendesign primer dengan bantuan komputer pada kenyataan, ketika pCR akan menghasilkan hasil yang negatif karena primer yang dipake tidak bisa nempel pada dna target.

• Digunakan enzim DNA polimerase yang tahan pada suhu 95oC (misal enzim taq polymerase dari Thermus aquaticus yang berasal dari kawah à reaksi enzimatik dilakukan pada suhu ekstrem). Jadi, harus enzim yang tahan akan suhu yang panas karena enzim yang tidak tahan akan mengalami denaturasi.

Proses

1. Denaturasi: pemisahan untai ganda menjadi tunggal, terjadi pada suhu 90-950C
2. Annealing/Priming: perlekatan primer pada ssDNA target; pada suhu 50- 650C
3. Elongasi: reaksi polimerasi/pemanjangan rantai DNA; pada suhu 68-720C Di sini juga dapat kita lihat betapa menguntungkannya PCR ini karena dengan 6 siklus saja, dapat dihasilkan 64 kopi DNA. 30 siklus àmilyaran kopi.

Sekuensing DNA

• Dalam rekayasa genetik digunakan metode sekuensing untuk mengetahui urutan nukleotida pada Gen.
• Metode sanger; di mana dua utas dsDNA yang tidak diketahui urutan basa N nya, akan didenaturasi membentuk ssDNA.
  
• Salah satu untai akan dijadikan template untuk sintesis untai pasangannya.
  
• Intinya, dengan mengetahui satu untai DNA, dapat diketahui untai lainnya karena saling berkomplementer.
• ssDNA template kemudian ditambahkan banyak dNTP yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan DTTP.
• Ditambahkan pula primer untuk memulai sintesis dan enzim DNA polimerase untuk sintesis pasangan ssDNA yang menjadi template.
• Adonan ini kemudian diramu dan dibagi ke dalam empat tabung. Dengan demikian, setiap tabung memiliki ssDNA, dNTP yang kaya, serta enzim DNA polimerase yang sama rata.
• Yang berbeda, tabung I diberi ddATP yang diberi label dengan warna merah, tabung II dengan dTTP (biru), tabung III dengan dCTP (hijau), serta tabung IV dengan dGTP (kuning). Molekul ddNTP ini berbeda dengan dNTP karena tidak memiliki molekul O pada karbon 3’ dari ribosa, sehingga pemanjangan rantai
• DNA terhenti bila rantai mengikat ddNTP spesifik di masing-masing tabung tersebut (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP) atau diterminasi.
• Hasilnya, ketika terjadi elongasi primer, dNTP akan berkompetisi dengan ddNTP dalam berikatan dengan basa N pada ssDNA sebagai template.
• Ex: Di ssDNA (template), sekuens basa N (setelah basa yang diduduki oleh primer) adalah GATCA. Pada tabung I yang berisi dATP dari dNTP dan ddATP sintesis akan berlangsung hingga mencapai posisi T, di mana dATP akan berkompetisi dengan ddATP untuk berikatan. Bila diduduki oleh dATP, sintesis tetap berlanjut. Bila tidak, ddATP yang mengikat, akan terjadi terminasi, sehingga sintesis berhenti, terbentuk fragmen, dengan ujung yang berwarna merah bila dianalisis.
• Hasil akhirnya berupa fragmen-fragmen yang terpotong di daerah tertentu akibat terminasi dengan berat molekul yang berbeda-beda à dielektroforesis, sehingga memberi warna yang berbeda. Hasilnya dapat dianalisis secara statistik. Komputer akan membaca urutan-urutan tersebut. Lihat yang mana yang paling atas.
• Dulu, orang melakukannya dengan cara diekspos ke suatu film dan dibaca satu per satu. Sekarang, cukup disinari dan akan ditangkap oleh sensor à dibaca, lalu disusun menjadi suatu grafik yang ditampilkan oleh layar komputer secara runut. Adakalanya antara basa N yang satu berhimpitan dengan yang lain, sehingga tinggal dibaca sinyal yang paling kuat.